EVOLUTION DES RECHERCHES

 

La thématique générale devint :

Etude physiologique, biochimique et cytologique des mécanismes de résistance de végétaux cultivés à des champignons pathogènes. La résistance induite. Physiologie du stress

Matériel : Phytophthora capsici  Midiou sur Piment Capsicum annuum (deux variétés génétiques : sensible et résistante Yolo et phyo).

Le Mildiou du Piment, dont l’agent pathogène est le Phytophthora capsici, représente l’un des facteurs limitants de la culture de cette solanacée dans tout le bassin méditerranéen.

Ce champignon attaque les racines et le collet des plantes provoquant un flétrissement rapide et l’apparition de lésions vasculaires létales à court terme. Les procédés classiques de lutte chimique s’étant avérés insuffisants, des moyens biologiques d’intervention furent recherchés : résistance variétale ou induction artificielle d’un état résistant.

I.        Etude Biochimique d’une interaction hôte-parasite: Phytophthora capsici-Capsicum annuum

(M.J. GRANGEON, Thèse de 3ème cycle, soutenue en1978).

Nos travaux ont montré que l’infection provoque une stimulation de l’activité des hydrolases acides lysosomales telles que : la phosphomonoestérase, la phosphodiestérase et la phospholipase D, tandis que d’autres enzymes comme la b-glycosidase et les protéases ne sont pratiquement pas activées. Les activités phosphodiestérasiques sont fortement stimulées lors de l’infection puisque les activités des lots contaminés sensible (Yolo) et résistant (Phyo) sont respectivement de 3 à 5 fois supérieures à l’activité témoin des plantes saines. La variété résistante dispose d’un pool hydrolasique lysosomal supérieur à celui du pathogène qui lui permettrait de mieux combattre l’agresseur.Nous avons pu constater en outre l’intervention du système Phytolysosomal dans des cas pathologiques naturels : anoxie, mercuresceine, iradiation, Virus du Persil, Crown Gall , nodules des légumineuses et même dans le cas de la dédifférenciation de cellules de la tige de tomate lors du percement de racines adventives . Nous avons d’autre part pu constater  que l’infection provoque une très forte augmentation de l’activité peroxydasique globale chez la variété sensible et plus encore chez la variété résistante, mais est sans effet sur l’activité polyphénoloxydasique. La participation de la péroxydase dans les  réactions de défense des plantes pourrait s’expliquer par le pouvoir fortement inhibiteur de cette enzyme sur la croissance mycélienne. Enfin la forte stimulation de la Phénylalanine-ammonium lyase paraît liée aux mécanismes de défense de la plante par la production de phénols.

II.       Mode d’action d’une phytoalexine, Capsidiol, sur un champignon phytopathogène responsable du Mildiou du Piment.

(M. TURELLI, Thèse de 3ème cycle soutenue en 1983).

Une fraction membranaire du pathogène est incubée pendant 1 H et 4 H en présence de Capsidiol purifié (250 mg/ml) : l’analyse qualitative et quantitative des phospholipides (chromatographie bidimensionnelle) révèle une dégradation des phospholipides des membranes du champignon, diminution de 33 %. Les lipides neutres sont relachés et 50 % des protéines sont extraits des membranes. Ces résultats démontrent une action nocive du Capsidiol sur les phospholipides du pathogène qui entraîne vraisemblablement une modification dramatique de la perméabilité des membranes du Phytophthora.

Ces résultats expliquent en partie le rôle de la phytoalexine dans l’interaction hôte parasite et l’efficacité d’une synthèse rapide de Capsidiol par la variété résistante : cette potentialité est à coup sûr l’un des facteurs de la résistance.

Des contrôles en microscopie électronique à haute résolution et après cryodécapage ont permis de confirmer l’action dégradante du Capsidiol : les culots membranaires des témoins présentent une structure membranaire classique à structure tripartite bien individualisée.   In situ : la phytoalexine provoque un delitement de l’exostructure pariétale, ainsi que des altérations du plasmalemme des mitochondries et de l’appareil de Golgi.

III.      Etude d’une induction chez Capsicum annuum  par des fractions membranaires du mycélium de Phytophthora capsici   à l’aide d’un nouveau test biologique. (C. COULOMB, PH.J. COULOMB)

Le dépôt de fractions membranaires légères purifiées sur gradient de densité discontinu, sur la face inférieure de cotylédons en survie sur de l’eau induit une résistance proche de 100 % après 4 jours de contamination. Il s’agit donc là d’une résistance induite  et .ce en l’absence de Capsidiol . On constate d’autre part une perte d’environ 50 % de la résistance induite par les fractions du pathogène lorsque les cotylédons de l’hôte ont été mis en présence de cycloheximide

Ces résultats mettent donc en évidence l’activité inductrice de résistance-sans induction de Capdidiol- des fractions membranaires du pathogène. Les expériences faisant appel au test biologique à l’aide de cotylédons en survie ont permis de constater que lorsque l’inoculum est déposé très précisément sur le spot de l’élicitation : on obtient une résistance induite sans apparition de Capsidiol. Si l’inoculum est déposé en dehors du spot de l’élicitation, l’élicitation est alors inefficace : il n’y a pas de résistance induite. Il semble donc dans ce cas que l’élicitation soit localisée au spot absorbé. L’état physiologique très particulier d’un cotylédon (organe de réserve vite caduque) conjugué aux conditions très particulières de la survie nous a conduits à faire « absorber » l‘éliciteur par les racines d’une plante entière et donc en parfaite condition physiologique. Après élicitation nous avons alors pu constater que la résistance induite était généralisée à toute la plante. En effet l’apport d’inoculum est alors inefficient sur les parties aériennes de la plante.

IV.     Etude ultrastructurale de l’interaction hôte-parasite. Caractérisation cytologique de la résistance (C. COULOMB, Ph.J.COULOMB)

Une étude cytologique préliminaire nous a permis de visualiser la pénétration du parasite dans les cellules foliaires des variétés sensible et résistante. La résistance se traduit morphologiquement par l’apparition d’un cal ou « apposition wall » élaboré par les cellules qui se trouvent en contact direct avec le champignon. Dans ces cellules nous avons pu mettre cytochimiquement en évidence le développement d’une forte activité péroxydasique. Le rôle important joué par les péroxydases dans la biosynthèse des lignines témoigne donc de leur intervention rapide en vue d’édifier une barrière à la pénétration du pathogène. Ce résultat cytochimique confirme les résultats biochimiques cités plus haut. Il convient d’autre part de noter que le champignon ne présente pas d’activité péroxydasique nettement décelable.

La détection cytochimique de la phosphatase acide dans la zone de nécrose révèle une très forte activité au niveau des dictyosomes et du système vacuolaire du parasite alors que les cellules de l’hôte sont totalement désorganisées. L’existence d’un système lysosomal fongique a été démontrée.

V.      Contribution à l’étude de l’interaction Capsicum annuum-Phytophthora capsici  . Action d’un fongicide de synthèse : l’éthylphosphyte d’aluminium (EPAL). (R. LORIENT, Thèse de 3ème cycle soutenue en 1984).

Nous avons mis en évidence que l’acide phosphoreux, produit de la dégradation de l’EPAL dans la plante est présent dans les feuilles de piments traités par arrosage racinaire : l’EPAL présente donc une systémie ascendante. Le fongicide entraîne une diminution des nécroses sans pour autant induire la biosynthèse de Capsidiol.

Le traitement des plantes à l’EPAL

– ne modifie pas la composition globale en pigments, glucides et acides aminés des tissus foliaires.

– mais après contamination par le P. capsici  nous avons noté chez la variété sensible une augmentation notable des teneurs en sucres solubles : saccharose, fructose et glucose. Les valeurs observées sont alors identiques à celles rencontrées dans les tissus de plantes contaminées traitées à l’EPAL. Enfin, les mesures des nucléotides adényliques, réalisés dans les feuilles de C. annuum  ont permis de constater que les sommes des nucléotides et des liaisons riches en énergie, l’ATP, le rapport ATP/ADP et la charge énergétique augmentent chez la variété sensible contaminée alors qu’ils restent stables chez la variété résistante.

VI      Contribution à l’étude d’une interaction hôte -parasite : Capsicum annuum-Phytophthora capsici. Rôle des enzymes à cytochrome P450 en utilisant la transcinnamate 4-hydroxylase comme modèle d’étude.

(Isabelle SAIMMAIME, Thèse Doctorat nouvelle formule soutenue en 1990)

Les réactions d’oxydation occupent une place importante dans les biotransformations des xenobiotiques chez les animaux. Elles sont réalisées par des oxygénases à fonctions multiples (OFM) localisées dans les microsomes. Le système végétal est très inductible par blessure, lumière, ions, herbicides qui induisent le cytochrome P450 et les hydroxylations qu’il catalyse. Nos travaux portent sur l’intervention de monooxygénases dans le métabolisme du Capsidiol lors de l’interaction : P. capsici – C. annuum.

Nous avons détecté :

–        un pic correspondant au cytochrome b5 dans les microsomes des variétés sensible et résistante témoins puis contaminées et également chez le champignon.

–        par contre nous n’avons pas encore réussi, dans le cadre de notre protocole expérimental, à déceler le P450. Seul un pic correspondant au P420  apparaît.

D’autre part, dans le surnageant des microsomes il n’y a pas de b5, nous détectons une bonne qualité de P420 (forme soluble du P450) dans les deux variétés témoins et contaminées et chez le champignon.

Enfin, après induction par une solution renfermant du MnCl2 et du FeCl3 l’analyse révèle dans les surnageants à 10 000 g et à 100 000 g deux pics correspondant au P450 et au P420.

Des résultats identiques ont été obtenus avec des plants incubés dans un milieu de culture de P. capsici  de 21 jours pendant 48 heures

VII.      Comportement de quelques enzymes du métabolisme oxydatif et des phénols au cours des interactions du Piment avec le Phytophthora capcici  ou avec le Virus de la mosaïque du Tabac (VMT).

Y. LIZZI (Thèse Doctorat nouvelle formule soutenue en 1991).

Une variété de Piment résistante au Mildiou a été obtenue par rétroisements génétiques. Stable en laboratoire, elle perd sa résistance au champignon dès qu’elle subit une première attaque par le virus de la mosaïque du tabac (VMT) en plein champ. Cette variété résistante l’est par hypersensibilité à la souche de virus Po.

Les résultats montrent :

–       l’apparition, après l’infection virale souche Po des deux variétés, sensible et résistante, d’une  fraction de protéines solubles de faible poids moléculaire.

–       Une augmentation significative du niveau peroxydasique ainsi que l’apparition d’isoperoxydases.

Enfin, l’infection par la souche Po induit une réaction d’hypersensibilité qui se traduit par une plus faible amplitude de l’activité peroxydasique que dans le cas d’une infection par la souche P1-2  et ce chez les deux variétés.

VIII.    Mise en place et rôle du cal de cicatrisation dans des boutures d’Oeillet (Dianthus caryophyllus) cultivées in vitro et infectées par le Phytophthora parasiticia .

M. MARTINEZ JIMENEZ. (Thèse Doctorat nouvelle formule soutenue en 1992).

L’étude cytologique et biochimique de la mise en place du cal de cicatrisation chez des boutures d’oeillet (Dianthus caryophyllus cultivar scania sensible à Phytophthora parasitica) cultivées in vitro nous a permis de souligner le rôle essentiel joué par le cambium dans la rapidité du déclenchement des divisions, immédiatement suivi par la dédifférenciation des autres tissus : 4 jours suffisent à l’édification du cal de cicatrisation chez les boutures cultivées in vitro  alors que 7 sont nécessaires en culture traditionnelle.

Le colmatage des brèches, la lyse des tissus lésés stimulent un métabolisme de « réparation » auquel participent, phosphatase acide, peroxydase et polyphénoloxydase.

Le processus de dédifférenciation et l’intense activité mitotique s’accompagnent d’un enrichissement en protéines totales, de l’intensification des échanges intercellulaires et du trafic apoplastique. La dédifférenciation n’affecte pas les tissus du parenchyme cortical (qui seront complètement désorganisés lors de la sortie des racines) et peu ceux du parenchyme médullaire. C’est à leur niveau que le pathogène sévit lorsqu’il est confronté à la bouture cicatrisée.

La bouture fraîchement sectionnée est entièrement colonisée par P. parasitica. La bouture cicatrisée est indemne de toute atteinte fongique sur toute la zone dédifférenciée. C’est à son niveau que les activités peroxydasiques et polyphénoloxydasiques sont les plus intenses ; elles se comportent comme des facteurs de résistance.

Les tissus sensibles non dédifférenciés de la bouture cicatrisée se comportent différemment de ceux des boutures témoins vis à vis du pathogène. Il semble qu’un certain nombre de facteurs induits lors de la formation du cal ont créé à leur niveau, les conditions d’une amorce de résistance insuffisante toutefois pour s’opposer au pathogène.

IX.     Processus d’Induction d’embryons haploïdes par du pollen irradié chez le melon. Réponses du pollen à l’irradiation gamma.

F. CUNY, (Thèse Doctorat nouvelle formule, soutenue en 1992).

La réponse du pollen de melon à l’irradiation gamma est étudiée dans l’optique de la détermination du processus d’induction d’embryons haploïdes.

– Quelles que soient les doses d’irradiation entre 0,15 et 2,5 KGray, l’induction d’embryons haploïdes d’origine maternelle, est toujours présente.

– L’étude histologique indique que le melon possède un mégagamétophyte de type Polygonum à huit noyaux et sept cellules, chacune montrant une forme différente de spécialisation structurale. La première caryogamie de la double fécondation a lieu deux jours après la pollinisation et aboutit à la mise en place d’un albumen de type nucléaire dont l’haustorium persiste à l’état coenocytique. La deuxième caryogamie s’achève trois jours après la pollinisation avec la formation de zygote dont la différenciation de type crucifère ne s’amorce que deux jours après. Lorsque le pollen est irradié, l’albumen forme une masse compacte cellularisée dépourvue d’haustorium. Généralement, les pseudo-zygotes, vacuolisés et chargés en amidon, se divisent et évoluent en proembryons anormaux qui avortent. Parfois, l’oosphère se développe en un embryon haploïde selon un processus de pseudogamie.

– Le pollen de melon bicellulaire germe in vitro à un taux de 98%. Des doses d’irradiation supérieures à 2,5 kGy sont nécessaires pour réduire significativement la vitesse de croissance du tube pollinique et affecter la division de la cellule génératrice. Ainsi, tant que le pollen est capable de germer correctement, l’induction d’embryons haploïdes se réalise.

– Les tubes polliniques sont caractérisés par une zonation ultrastructurale qui témoigne de spécialisations fonctionnelles. Les mitochondries, l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique montrent par leur organisation et leur développement, une activité intense. Les vésicules Golgiennes chargées en précursseurs polysaccharidiques migrent vers l’apex du tube pollinique où leur fusion avec leur membrane plasmique contribue à l’élongation apicale de ce tube. Dans l’espace périplasmique, la polymérisation des précurseurs polysaccharidiques, initiée dans les vésicules golgiennes s’achève et contribue à l’édification de la couche pariétale pectocellulosique. Par ailleurs, la voie exocytaire réalisée entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique est responsable de la mise en place de la couche pariétale interne callosique. La vacuolisation de la zone distale est assurée par les profils réticulaires et par les provacuoles golgiennes. Lorsque le pollen est irradié à fortes doses, la vacuolisation est faible et la croissance pariétale fortement affectée. L’altération du système membranaire limite les processus exocytiques de reconnaissance indispensables à la croissance du tube pollinique.

Le sporoderme du grain de pollen, épais et infrastructuré, semble constituer une protection efficace contre le rayonnement gamma.

X –          Recherche des facteurs responsables de l’évolution de la qualité de la chair du Melon charentais. Cas de la vitrescence. P.BORIOLI (Rapport de Recherche du COVAPI)

Les analyses cytologiques et cytochimiques ont permis de caractériser la fragilisation du systéme pariétal des Melons vitrescents. La plupart des parois cellulaires présentent des altérations ponctuelles qui se traduisent par la disparition des couches cellulosiques des deux cellules adjacentes. La lamelle pectique finit par se rompre entraînant la formation d’un mictoplasme dégénérescent.

XI –         L’Etude cytologique et biochimique de l’interaction Pin sylvestre-Ceratocystis bruneociliata..

M.H.LEVAGUERESSE-DAURADE (Stage de mise au point technique)

Les prélèvements de liber effectués sur des pins sylvestres agés de 34 ans ont permis d’analyser leur composition en glucides et en phénols libres et conjugués, au bout de 7, 14 et 21 jours après les traitements suivants: 1° forage mécanique, 2° infestation par un scolyte (Ips sexdentatus ) 3° contamination par un champignon ( Ceratocystis bruneociliata ), fréquemment associé à Ips.

On ne note aucune variation de la composition glucidique sous l’effet du traitement par Ips, alors que le forage mécanique entraîne une légère diminution des quantités de saccharose, au point de lésion, pendant toute la durée des observations. De même, l’inoculation du champignon produit une baisse des glucides libres (glucose et fructose) et des réserves  circulantes (saccharose) de 7 à 21 jours.

En ce qui concerne les phénols libres, les 3 traitements ont un  effet sur une fraction de mobilité comparable à celle de l’acide cinnamique. Les effets du forage mécanique ne se manifestent  sur cette fraction qu’à 7 jours, alors que pour les 2 autres traitements, ils se prolongent encore à 14 jours. Deux autres phénols libres semblent caractéristiques, l’un de l’infestation par l’insecte, l’autre de l’inoculation par le champignon.

Alors que Ceratocystis n’entraîne des variations que sur une fraction hétérosique qui a été  identifiée au ß-glucoside del’alcool coniférique, l’infestation par Ips se traduit par des variations de plusieurs hétérosides. La perforation artificielle ne provoque, quant à elle, aucune modification des glucides conjugués et présente donc la plus faible toxicité apparente.

XII.    Modifications biochimiques et structurales de la paroi de la cerise Bigarreau-Burlat au cours de sa maturation. C. BATISSE (Thèse soutenue en 1994)

On observe une synthèse de sucres neutres surtout glucose, rhamnose et arabinose et une dégradation du galactose. Au niveau pondéral, on observe une solubilisation des pectines de la fraction PSH vers les fractions PSE et PSO, mais aussi une augmentation de la fraction PSOH pouvant correspondre à un accrochage plus important de pectines de la fraction PSH.

Pour les sucres simples, on note une solubilisation des galactanes, très importante dans la fraction PSH, qui sont peut être remplacés par des chaînes d’arabinose. Ce phénomène de solubilisation de galactanes est trouvé dans les travaux antérieurs et expliqué comme étant un démasquage des sites d’action de la polygalacturonase. La polygalacturonase et la pectine lyase, lors d’un essai de dosage d’activité sur le stage V9, n’ont pas pu être détectées. La PG n’a jamais pu être mise en évidence chez la cerise.

On observe aussi une diminution du rhamnose des fractions PSH et PSOH sans avoir de fortes augmentations au niveau des fractions PSE et PSO. On note aussi une augmentation de la quantité de rhamnose dans le MIA, ce qui conforterait l’idée d’un accrochage de pectines sur le squelette cellulosique.

On constate une faible diminution des ramifications de PSH et PSOH et une très légère augmentation des sucres neutres dans les fractions PSE et PSO. Le matériel solubilisé semble très peu ramifié.

On observe une augmentation de glucose et de xylose dans la fraction PSOH qui peut être due à une synthèse ou une solubilisation d’hémicellulose. L’étude de l’évolution des sucres neutres des fractions PSCOH et R devrait permettre de répondre à cette question.

Les composés solubilisés, retrouvés dans les fractions PSE et PSO, présentent le même poids moléculaire. On aurait donc une solubilisation sans dépolymérisation.

Les premières photos en cytologie, comparant la paroi d’un fruit vert et d’un fruit mûr montrent une ouverture de la paroi au niveau de la lamelle moyenne. Les résultats biochimiques obtenus nous permettent d’expliquer ce phénomène.

Deux phénomènes intervenant pendant la maturation vont permettre le renforcement de l’accrochage d’une fraction pectique ramifiée au squelette pariétal.

`- Le déplacement de chaînes latérales longues d’une pectine peu ramifiée vers une pectine très ramifiée, augmentant la capacité de liaison de cette dernière.

– La synthèse d’hémicellulose, permettant l’augmentation du nombre des liaisons entre hémicellulose et pectine.

Les pectines ramifiées sont tirées vers le squelette pariétal, alors que les pectines très peu ramifiées sont totalement détachées du squelette pariétal.

XIII.    Participation du Capsidiol à l’expression de la résistance induite chez le Piment Capsicum annuum.

(C. POLIAN, thèse soutenue en 1997).

L’étude de protoplastes -donc de cellules dépourvues de paroi- permettra une étude plus fine des cytomembranes et de leurs modifications éventuelles (composition moléculaire, perméabilité…) au cours de l’interaction.

Nous avons pu, après une digestion ménagée à l’aide de macérozyme, driselase et cellulase, obtenir une bonne concentration de protoplastes (entre 5 et 8 Millions/g) relativement stables : durée de vie : 1 semaine sans contamination. Des expériences nous ont permis de démontrer que la fraction soluble d’extraits de Piments élicités (résistants ou sensibles) provoque la lyse de protoplastes de piments résistants ou sensibles, alors que des extraits de Piments non élicités ne provoque pas de lyse.